2 × Taq Master Mix (Dye Plus)
高纯度耐热DNA聚合酶
菌落PCR;基因鉴定;
· 优化的缓冲体系,便于快速得到理想的扩增结果
· 即用型的预混液,较大程度地减少实验步骤
本产品由克隆有Thermus aquaticus DNA Polymerase 基因的大肠杆菌表达并经过多步纯化精制得到,不含核酸内切酶、核酸外切酶以及细菌DNA。Taq DNA Polymerase 具有5’ → 3’ 聚合酶活性和5’ → 3’ 外切酶活性,但无3’ → 5’ 外切酶活性。PCR 产物的3’ 端带A,可克隆至T 载体,并适用于ClonExpress 快速克隆试剂盒(C112/C113/C115/C601)。
组分 | P112-01 | P112-02 | P112-03 |
2 × Taq Master Mix (Dye Plus) | 5 × 1 ml | 15 × 1 ml | 50 × 1 ml |
-20℃保存。
Q1:扩增效率低,实验组无扩增条带。
A1:(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解;引物设计是否合理,可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(2) 模板
长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开,此时加入PCR Enhancer(货号P021),可以有效降低解链温度;模板的GC含量过低会导致扩增效率较差,可适当延长引物长度或通过梯度PCR摸索合适的反应条件;模板中存在抑制物,特别是甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,会造成DNA脱嘌呤而影响PCR结果,建议稀释使用或重新制备;若模板为cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。
(3) 酶
反应所用的酶因保存或运输不当而失活,建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。
(4) 扩增体系
反应体系配制错误,建议重复实验。
(5) 反应程序
检查变性温度是否准确,PCR仪指示温度与实际温度是否相符。如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活;温度过低则模板变性不彻底。可对退火温度设置梯度,摸索合适的退火温度。检测延伸时间是否充足。
(6) Mg2+浓度不合适
Mg2+浓度过低可影响PCR产量甚至使PCR扩增失败;Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性,应适当调整Mg2+浓度。
Q2:扩增的条带亮度不太亮。
A2:(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解。
(2) 模板
首先确认模板的质量,长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;如果模板没有了,可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。
(3) 酶
可适当提高酶的使用量。
(4) 反应程序
可尝试使用Touch Down程序;延长延伸时间,提高循环数。
Q3:扩增特异性差,非特异性扩增。
A3:(1) 引物
引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体,可降低引物浓度进行优化,必要时重新设计引物。
(2) 模板
模板不纯,被污染,需重新制备模板。
模板降解或过量,通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。
(3) 反应程序
反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带,可通过提高退火温度,降低循环数调整;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。
(4) 酶
酶量加入过多。Taq系列:50μl体系加2U。
Q4:空白对照出现扩增产物。
A4:(1) 引物设计不合理
扩增序列与非目的扩增序列有同源性,PCR也可以扩增出非靶序列的序列。
(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致,说明有污染
更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。
(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染,可用巢式PCR方法减轻或消除污染。
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