2 × KeyPo Master Mix (Dye Plus)
一款使用方便、产量高的KeyPo高保真酶Mix
分子克隆;基因鉴定;
· 快速扩增:5 sec/kb
· 保真度高:保真度是 Taq DNA Polymerase 的57倍
· 产量更高:带给您更亮的目的条带
· 操作便捷:加入引物和模板即可进行扩增,产物含蓝色Loading Buffer,可直接电泳检测
本产品兼顾高成功率和高灵敏度的同时,扩增速度可达5sec/kb,保真度是Taq酶的57倍。产品添加了可在常温下抑制5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性的两种单克隆抗体,可进行高特异性的热启动PCR反应。只需加入模板和引物即可进行扩增,使用方便,且含电泳指示剂,PCR反应完成后无需额外添加loading buffer,可直接点样进行电泳。
组 分 |
PK511-01 |
PK511-02 |
PK511-03 |
2 × KeyPo Master Mix (Dye Plus) |
1 ml |
5 × 1 ml |
15 × 1 ml |
-30 ~ -15℃保存
Q1:扩增效率低,实验组无扩增条带。
A1:(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解;引物设计是否合理,可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(2) 模板
长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开,此时加入PCR Enhancer(货号P021),可以有效降低解链温度;若模板为cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。
(3) 酶
反应所用的酶因保存或运输不当而失活,建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。
(4) 扩增体系
反应体系配制错误,建议重复实验。
(5) 反应程序
检查变性温度是否准确,PCR仪指示温度与实际温度是否相符,如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活,温度过低则模板变性不彻底;退火温度不合适,可对退火温度设置梯度,摸索适合的退火温度;根据引物Tm值设置退火温度,如引物Tm值≥72℃,可删除退火步骤,直接进行后续的延伸步骤(两步法PCR)。
Q2:扩增的条带亮度不太亮。
A2:(1) 引物
检查人工合成的引物是否降解。
(2) 模板
首先确认模板的质量,长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;如果模板没有了,可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。
(3) 反应程序
可尝试使用Touch Down程序;延长延伸时间,提高循环数。
Q3:扩增特异性差,非特异性扩增。
A3:(1) 引物
引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体,可降低引物浓度进行优化,必要时重新设计引物。
(2) 模板
模板不纯,被污染,需重新制备模板。
模板降解或过量,通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。
(3) 反应程序
反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带,可通过提高退火温度,降低循环数调整;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。
Q4:扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。
A4:(1) 胶
制胶时要使胶完全融化。
(2) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解。
(3) 模板
模板降解或过量,可通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长,模板是cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度,逆转录时不加随机引物重新逆转录。
(4) 反应程序
反应程序不够优化。退火温度不合适,可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度;尝试Touch Down 程序。
Q5:空白对照出现扩增产物。
A5:(1) 引物设计不合理
扩增序列与非目的扩增序列有同源性,PCR也可以扩增出非靶序列的序列。
(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致,说明有污染
更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。
(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染,可用巢式PCR方法减轻或消除污染。
Q6:高保真酶扩增保真性差,存在突变。
A6:高保真酶在PCR时扩增产物有突变,可以从以下几点来分析:
(1) 模板本身存在突变
检查模板,若模板是质粒,建议送质粒去测序;若模板是cDNA,建议重复实验,如果仍有突变,可能是cDNA有问题,建议重新制备cDNA,制备cDNA前检测RNA的完整度及纯度。
(2) 模板长时间在紫外光下照射,引入突变
切胶回收过程中避免长时间在紫外光下照射。
(3) 基因序列与NCBI上的不一致
建议再重复一次送去测序,若结果和上一次一样,说明序列可能和NCBI上的不一致。
(4) 少量序列存在非严谨序列
有相似重组序列,导致重组错位。
Q7:逆转录后的产物cDNA作为模板,使用高保真酶,一次应该加多少体积?
A7:说明书建议cDNA模板使用量为1-5μl(不超过PCR反应总体积的1/10),可在这个范围内尝试不同的使用量,摸索合适使用量。
Q8:高保真酶扩增完的产物是否带A,若后面要做TA克隆该如何进行?
A8:高保真酶扩增完的产物不带A,后续做克隆可尝试使用Vazyme无缝克隆产品C601;若后面做TA克隆可用普通的Taq酶进行加A反应。
Q9:带颜色的PCR产物是否影响酶切效果?
A9:经测试,带颜色的PCR产物不会影响酶切效果。
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